Les systèmes de microscopie bicolore enregistrent simultanément la fluorescence de marqueurs fluorescents rouges et verts, ou d'indicateurs calciques génétiquement codés (GECI). Ils permettent d'enregistrer l'activité neuronale de deux populations cellulaires marquées par un marqueur différent, par exemple GCaMP, RCaMP, ou des mêmes populations cellulaires marquées par deux indicateurs dans la même région cérébrale.